- lip2000脂質(zhì)體2000的兩種轉(zhuǎn)染方法
- 點擊次數(shù)：5370 更新時間：2016-02-24
- lip2000脂質(zhì)體2000適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下zui方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。
用lip2000脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做。先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時間，DNA可從1-5ug和孵育時間6h，開始，按這兩個參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者*的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時間。因LR對細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時間以不超過24h為宜。COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。
lip2000脂質(zhì)體2000的轉(zhuǎn)染方法常見有兩種，具體如下：
一、快速lip2000脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法操作步驟
(1)將細(xì)胞以5 x 10^5個/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h，使其達(dá)到50%-60%板底面積。在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。
a、在1ml無血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。
b、旋轉(zhuǎn)1s，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。
c、室溫下放置5-10min，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。
(2)棄去細(xì)胞中的舊液，用1ml無血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天。
(3)再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。
(4)吸出DMEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培養(yǎng)24-48h。
(5)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。
二、穩(wěn)定的lip2000脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染法
接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。
DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。
在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培養(yǎng)48h。
吸出DMEM，用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長一定時間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。
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